PRACTICA:PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS

SEP                                      DGETI                                SEMS

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NO. 199

“EMILIANO ZAPATA SALAZAR”

MATERIA: PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLÓGICOS

PROFESOR: DR. VICENTE MARTÍNEZ FRAGOSS

ALUMNO: SARAI PEREZ TOVAR

GRADO: 4°             GRUPO: DM

ESPECIALIDAD: LABORATORISTA CLÍNICO

SEMESTRE: ENERO-JULIO 2012

PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS

OBJETIVO

 Aprender las técnicas de preparación del frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio macroscópico de cultivos bacterianos, para poder así dar pauta a la identificación de las principales formas bacterianas y comprender la importancia de las tinciones y su adecuado uso.

FUNDAMENTO

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para poder realizar la descripción de estos.

El microscopio más común es el de campo claro, en el cual la observación de células vivas es limitada, debido a que estas son incoloras y permiten el paso de un gran cantidad de luz.

Debido a este factor, la observación de frotis teñido es más recomendable.

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.

Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor.

MATERIAL

* Mechero de Bunsen

*Asa de siembra

*  Portaobjetos

* Microscopio

* Pizeta

* Tubos de ensayo

* Centrifuga

MATERIAL BIOLÓGICO:

*Muestra biológica: heces fecales frescas y orina

* Cultivos bacterianos

REACTIVOS:

*  Azul de metileno

* Alcohol etílico

* Fenol

* Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1.    Analizar macroscópicamente al medio de cultivo

2.    Llenar a la mitad un tubo de ensayo con agua destilada. Tomar un aplicador e introducirlo a la muestra de heces, tomando lo mas mínimo posible de estas y disolver en el tubo con agua.

3.    Tomar un poco de orina, depositarla en otro tubo de ensayo y centrifugar durante 5 minutos a 3 000 rpm.

Preparación de frotis:

1.    Lavar  y secar perfectamente los portaobjetos.

2.    Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol.

3.    Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.

4.    Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo, introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.

5.    Del tubo de agua con un poco de heces disueltas, se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la suspension, que posteriormente se extiende en el portaobjetos.

6.    Si hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el portaobjetos, con ayuda del asa previamente flameada.

7.    Del tubo de agua con un poco de heces disueltas, se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la suspensión, que posteriormente se extiende en el portaobjetos.

8.    Si hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el porta objetos, con ayuda del asa flameada.

Fijación del frotis:

1.    Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero).

2.    Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.

3.    Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

Tinción simple:

1.    Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.

2.    Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la pizeta con agua.

3.    Dejar secar al aire

4.    Observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

OBSERVACIONES

En el medio de cultivo agar sangre, se encontraban colonias puntiformes, blanquecinas, lisas, además de que eran hemolíticas del tipo B.

En el otro medio (amarillo) las colonias eran semejantes.

Frotis cultivo agar sangre 100x

Todo el campo se encontraba lleno de bacterias de morfología como de cocos, agrupados en sarcinas, por ser cultivo de exudado vaginal, se trataba de Gardnerella vaginalis.

 

Frotis heces 100x

Residuos de alimentos,E. coli y además destaca lo que parecía ser un huevecillo, que por su morfología semejaba al de una tenia.

Frotis orina, 100x

Distinguimos células epiteliales de las vías urinarias, pero además en la que está ubicada aproximadamente a las 10, se encuentran bacilos que la rodean.

RESULTADOS

En el frotis de orina y heces se encontraron bacilos cortos, tratándose de Escherichia coli, una enterobacteria, por eso es común encontrarla en heces.

En el medio de cultivo, en el cual había sido sembrado exudado vaginal se tomó de la colonia que estaba en el agar sangre, y tomando en cuenta las características macroscópicas y microscópicas, se determinó que se trataba de la bacteria Gardnerella vaginalis.

Es un bacilo inmóvil no encapsulado, puede presentar fimbrias y es corto con una longitud de 0.5. - 1.5 mm, lo que hace que parezca un cocobacilo pleomórfico, que usualmente se tiñe como Gramnegativo o Gram variable. Es un organismo anaerobio, presenta hemolisis del tipo beta en agar sangre humana. Son cataliza y oxidasa negativo.

Esta bacteria se va a poder aislar en agar, sangre incubado en anaerobiosis o en una atmósfera de 5% de CO2 a 35°c por 48 horas.

Se originan colonias translucida u opacas de 0.3 a 0.5 mm de diámetro, puntiforme, redondas, lisas, con hemolisis tipo beta.

CONCLUSIÓN

Para hacer un frotis debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el portaobjeto al aire caliente de la llama del mechero.

La fijación se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente. La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las bacterias.

Fuentes consultadas:

·         Gardnerella vaginalis, consultado el día 10 de marzo del 2012, en http://html.rincondelvago.com/gardnerella-vaginalis.html